双糖铁培养基含有乳糖和葡萄糖的比例为10:1，斜面为乳糖，底层为葡萄糖。只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。发酵乳糖的细菌，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。